Nefelometrické sledování růstu mikroorganismů na úrovni všeobecných i speciálních středních škol

Úvod:

Popisuje se nenákladný způsob měření kinetických změn zákalu při kultivaci mikroorganismů v kapalných půdách. Při provedení jednorázové kultivace mikroorganismů v kapalné půdě dojde k rozptylu světla na množících se mikroorganismech. Zákalometrem (fotometrem) se změří tento rozptyl jako funkce času a získají se fotometrické růstové křivky množících se mikroorganismů.

Princip:

Při kultivaci mikroorganismů dochází ke změnám růstové rychlosti. V jisté fázi lze růstovou rychlost popsat rovnicí X(t) = X (0)*emt , kde m je specifická růstová rychlost kultivovaného mikroorganismu, t je čas a X je veličina související s počtem jedinců v jednotce objemu. Při předpokladu, že množení mikroorganismů probíhá dělením jednoho mikroorganismu na dva lze definovat další parametr růstu mikroorganismů tzv. čas zdvojení ( generační čas) pomocí vztahu t2 = ln2/m.

Přístroje a pomůcky:

- zkalibrovaný školní zákalometr
- držák zkumavek do měřící komory zákalometru
- zkumavka o Ć 17 mm, Ć 19 mm resp. Ć 20 mm resp. kyvety nebo lahve
- míchadlo do zkumavky
- laboratorní pomůcky pro přípravu vzorků
- teploměr resp. termostat
- filtrační papír, filtrační nálevka, kádinka

Vzorky a chemikálie:

Vzorky pro nefelometrické sledování kultivací se připravují známými mikrobiologickými postupy popsanými zevrubně v dostupné literatuře [14]. Testované mikroorganismy jsou namnožovány na pevných agarových půdách zaočkovaných roztěrem. Po jejich dostatečném nárůstu jsou očkovací kličkou buňky resuspendovány ve velmi malém objemu sterilního fyziologického roztoku. Z této husté suspenze se následným ředěním připraví řidčí suspenze pomocí níž se naočkuje zvolená koncentrace buněk v tekuté půdě ve zkumavce, ve které se bude vzorek kultivovat a dále měřit.

Pracovní postup:

Po dobu kultivace se umístí připravené vzorky ve zkumavkách na stojanech ve standardním laboratorním termostatu. Ve zvolených časových intervalech se vzorky postupně vkládají do měřící komory zákalometru a během několika vteřin se odečítají naměřené hodnoty zákalu a zapisují se do tabulky pro další zpracování.

Postup vyhodnocení a příklad provedení:

Z tab. 3 naměřených hodnot se nakreslí graf závislosti zákalu vzorku na čase, tj. fotometrická růstová křivka sledovaného mikroorganismu. Pro stanovení m se na osu y vynáší přirozený logaritmus zákalů po odečtení výchozího zákalu Z0 na počátku inokulace tj. veličinu ln(Z- Z0). Hodnota specifické růstové rychlosti se získá jako směrnice přímky proložené exponenciální fází růstové křivky (např. metodou nejmenších čtverců). Byl sledován růst bakterie Lactobacillus plantarum ve 4 zkumavkách o různé počáteční koncentraci inokula v tekutém mediu MRS. V tab. 3 jsou spočítány hodnoty přirozeného logaritmu zákalu po odečtení počátečního zákalu vzorku. Graf na obr. 17. zobrazuje exponenciální fázi růstu mikroorganismů. Křivky jsou proloženy přímkami, jejichž směrnice udávají specifické růstové rychlosti pro jednotlivé vzorky:

vzorek č. 1: m = 0,394
vzorek č. 2: m = 0,404
vzorek č. 3: m = 0,410
vzorek č. 4: m = 0,393